Le Projet de génomique fonctionnelle du cerveau (Brain Functional Genome Program, BFGP) vise à améliorer notre compréhension du cerveau humain en développement en établissant un lien entre les sites d’expression des gènes et leurs fonctions. L’objectif est de fournir à l’ensemble des chercheurs qui travaillent sur les maladies neurologiques et neurodégénératives des technologies éprouvées et des outils ciblés. Le projet repose sur des technologies de pointe qui font la renommée de l’Institut du Cerveau : la visualisation 3D de l’expression génique (méthode iDISCO), la transcriptomique spatiale et la production de lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
Le Projet de génomique fonctionnelle du cerveau (BFGP) est une initiative multidisciplinaire de l’Institut du Cerveau qui vise à créer un ensemble intégré de ressources reliant l’expression spatiale des gènes, la distribution des protéines et la fonction des gènes dans le cerveau en développement.
Le projet s’articule autour de trois objectifs complémentaires.
Le premier objectif consiste à mettre au point un protocole innovant combinant l’hybridation in situ par fluorescence 3D de l’ARN (ARN 3D FISH), la transcriptomique spatiale (Visium HD, Visium V2 et GeoMx) et la protéomique spatiale sur les mêmes échantillons de tissus. Appliquée aux tissus fœtaux humains et aux tissus cérébraux de souris à des stades clés du développement, cette approche permettra d’obtenir un atlas multimodal restituant visuellement l’expression spatiale des gènes au cours du développement cérébral.
Le deuxième objectif vise à mettre en place une plateforme de criblage fonctionnel d’organoïdes corticaux dérivés de cellules iPS en utilisant l’inactivation génique par CRISPRi. Grâce à des systèmes dCas9 inductibles et constitutifs, le criblage permettra d’évaluer de manière systématique les effets de la répression de gènes associés à des maladies sur la neurogenèse, et d’établir ainsi un lien direct entre la fonction des gènes et les phénotypes neurodéveloppementaux.
Le troisième objectif consiste à développer l’infrastructure informatique nécessaire à l’intégration de ces ensembles de données, notamment des pipelines d’alignement d’images 3D-3D et 3D-2D, des outils d’analyse de transcriptomique spatiale à résolution unicellulaire, ainsi que des bases de métadonnées garantissant une traçabilité complète, depuis l’échantillon jusqu’aux données.
Ensemble, ces objectifs permettront de créer le premier atlas reliant les profils d’expression spatiale des gènes aux rôles fonctionnels des gènes dans le cerveau en développement. Le projet s’appuie sur les capacités technologiques uniques de l’Institut et favorise la collaboration interdisciplinaire entre biologistes expérimentaux, ingénieurs et spécialistes des données. Tous les outils, pipelines et ensembles de données seront mis à la disposition de la communauté scientifique conformément aux principes de la science ouverte.
Ambition
Pour comprendre comment le cerveau se développe et quels mécanismes perturbent son développement dans les maladies neurologiques et psychiatriques, il ne suffit pas de répertorier les gènes et leur localisation. Il faut adopter une approche intégrée pour analyser l’expression des gènes en trois dimensions dans leur contexte tissulaire natif, la mettre en relation avec la distribution des protéines et établir un lien entre les profils d’expression spatiale des gènes et leur fonction. C’est précisément l’ambition du Projet de génomique fonctionnelle du cerveau. En combinant, pour la première fois sur les mêmes échantillons, l’ARN 3D FISH, la transcriptomique spatiale et la protéomique spatiale, puis en associant cet atlas multimodal à un criblage fonctionnel systématique d’organoïdes corticaux humains, le projet BFGP constituera une ressource reliant l’expression spatiale des gènes et leur fonction biologique au cours du développement cérébral. Il n’existe actuellement aucun atlas proposant un tel niveau d’intégration. Grâce aux outils de calcul et aux pipelines d’analyse développés dans le cadre du projet, cette ressource sera entièrement accessible et reproductible, offrant ainsi une plateforme ouverte à l’ensemble de la communauté neuroscientifique. À terme, le projet BFGP permettra de déterminer où, quand et dans quels types de cellules les gènes associés à des maladies sont exprimés, ainsi que les processus affectés lorsqu’ils sont perturbés. Il jettera ainsi les bases nécessaires afin de comprendre quels mécanismes cellulaires favorisent l’apparition d’une maladie neurologique en présence d’un risque génétique, et d’identifier les populations cellulaires et les phases de développement les plus pertinentes pour envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Objectif 1 : Un nouveau paradigme pour le profilage spatial multimodal de tissus intacts.
Les technologies de transcriptomique spatiale ont révolutionné notre compréhension de la distribution de l’ARN dans les tissus et apporté de nouveaux enseignements sur l’organisation cellulaire et l’architecture tissulaire. Toutefois, les approches actuelles reposent encore essentiellement sur l’analyse de fines coupes en deux dimensions, ce qui limite l’étude de structures complexes en trois dimensions, telles que le cerveau. Notre projet entend pallier cette limite fondamentale. À notre connaissance, le protocole développé dans le cadre de l’objectif 1 est le premier à permettre la détection de plusieurs cibles d’ARN en trois dimensions par ARN 3D FISH (six gènes répartis sur deux séries d’hybridation), suivie d’une analyse par transcriptomique spatiale (Visium HD, Visium V2 ou GeoMx) et par protéomique spatiale (jusqu’à 20 anticorps) – toutes ces opérations étant réalisées de façon séquentielle sur un même échantillon. Cette stratégie multimodale, qui consiste à analyser un même échantillon, présente un intérêt majeur pour l'étude de spécimens rares et irremplaçables, tels que les tissus cérébraux fœtaux humains ou les échantillons tumoraux issus de patients, pour lesquels chaque coupe doit fournir le maximum d’informations. L’article décrivant la méthode utilisée est actuellement en cours de rédaction. Il abordera à la fois le protocole expérimental et le pipeline d’analyse associé, et devrait avoir des retombées importantes dans de nombreux domaines, notamment les neurosciences du développement, la neuro-oncologie et toutes les disciplines nécessitant un profilage moléculaire à résolution spatiale de tissus complexes. Au-delà des neurosciences, cette méthode est en principe transposable à tout type d’organe ou de tissu. Grâce à sa diffusion en libre accès, elle pourra être adoptée par d’autres laboratoires dans le monde.
Objectif 2 : Une plateforme de criblage fonctionnel accessible pour la biologie neurodéveloppementale.
Ces dernières années, des progrès importants ont été réalisés dans le criblage fonctionnel à grande échelle sur des modèles organoïdes en trois dimensions, essentiellement grâce à des approches groupées dans lesquelles des milliers de perturbations génétiques sont introduites simultanément et analysées par séquençage unicellulaire (p. ex., CROP-seq, Perturb-seq appliqués aux organoïdes). Malgré leur puissance, les criblages groupés ne permettent d’explorer qu’un nombre limité de dimensions phénotypiques : les analyses portent principalement sur les modifications transcriptomiques, tandis que les phénotypes spatiaux ou morphologiques, pourtant essentiels à la compréhension du développement cérébral, demeurent en grande partie inaccessibles. Notre projet se distingue par une approche résolument novatrice, qui repose sur le développement d’une plateforme de criblage CRISPRi en réseau sur des organoïdes corticaux dérivés de cellules iPS, dans laquelle chaque gène est inactivé et phénotypé individuellement. Ce format en réseau permet d’évaluer des phénotypes complexes et multidimensionnels, tels que la morphologie, la composition cellulaire, l’organisation spatiale et l’activité neuronale – autant de paramètres qui sont difficilement observables au moyen des approches de criblage groupées. À notre connaissance, il s’agit de la première initiative visant à mettre en place un criblage systématique en réseau à grande échelle sur des organoïdes corticaux. La conception d’un système lentiviral « tout-en-un », à la fois inductible et constitutif, fournit des outils de mise en œuvre flexibles, compatibles avec différents modèles expérimentaux. Les nombreuses corrections et améliorations apportées au cours de cette période – notamment la résolution des problèmes liés à la fuite de Cre et à la détection de GCaMP – constituent des connaissances pratiques qui profiteront aux équipes souhaitant s’engager dans une démarche similaire.
Ces outils et protocoles offriront à la communauté un cadre accessible pour déployer des approches de génomique fonctionnelle en réseau dans les systèmes organoïdes, comblant ainsi le fossé entre les criblages groupés et les études mécanistiques approfondies. À plus long terme, la possibilité de caractériser phénotypiquement l’inactivation de chaque gène dans un modèle tridimensionnel pertinent pour l’être humain permettra d’identifier les gènes impliqués dans les maladies, mais également les phénotypes cellulaires et structurels par lesquels ils agissent – des informations essentielles pour définir les cibles thérapeutiques prioritaires.
Objectif 3 : Infrastructure de calcul ouverte au service de l’intégration des données multimodales.
L’intégration d’ensembles de données spatiales hétérogènes (imagerie volumétrique 3D, transcriptomique spatiale 2D, protéomique spatiale) génère des défis informatiques auxquels les suites logicielles actuellement disponibles sur le marché ne répondent que partiellement. Les pipelines développés dans le cadre de l’objectif 3 pour l’enregistrement d’images 3D-3D, l’alignement 3D-2D et l'analyse de données spatiales à résolution unicellulaire fondée sur la segmentation des noyaux constituent des avancées importantes pour les communautés de l'imagerie biologique computationnelle et de l'analyse des données omiques spatiales. Ces outils sont conçus pour être diffusés en libre accès, ce qui assure leur reproductibilité et leur accessibilité au plus grand nombre. Les bases de métadonnées conçues pour garantir la traçabilité des échantillons jusqu’aux données répondent également à un besoin croissant exprimé sur le terrain, à savoir permettre une gestion rigoureuse des données dans le cadre de protocoles expérimentaux complexes comportant de multiples étapes – une condition préalable à la reproductibilité des travaux scientifiques et au partage des données conformément aux principes FAIR. Ces contributions dépassent le cadre des seules questions biologiques et présenteront un intérêt pour toute équipe travaillant sur des données spatiales multimodales, en neurosciences comme dans d'autres domaines des sciences biomédicales.
